İnfluenza A/B Virüs ve RSV Validasyon Standartlarının Dijital PCR ile Kantitasyonu

Abstract

Mikrobiyolojik tanı laboratuvarlarında kullanılacak tanı testleri için kantitatif standartların kullanıldığı yöntem doğrulama (verification) veya geçerli kılma (validation) çalışmaları gereklidir. Nükleik asit testlerinde sentetik nükleik asit veya plazmit yerine tam virüs içeren standartların kullanılması; ekstraksiyon, revers transkripsiyon ve amplifikasyonu içerecek şekilde tanı testinin tüm basamaklarının gerçek yaşam koşullarında değerlendirilmesini sağlar. Solunum yolu virüsleri için nükleik asit testlerine yönelik ticari kantitatif standart materyaller sınırlıdır. Bu çalışmada; influenza A virüs (infA), influenza B virüs (infB) ve respiratuvar sinsityal virüs (RSV) için dijital polimeraz zincir reaksiyonu [digital polymerase chain reaction (dPCR)] kullanılarak, kantitatif nükleik asit standartları geliştirilmesi amaçlanmıştır. Çalışmada; RSV, infA, infB RNA pozitif olduğu bilinen nazofarengeal sürüntü örneklerinin havuzlanmasıyla hazırlanan örneklerdeki viral nükleik asit miktarı, ticari primer/prob setleri (Qiagen, Almanya) kullanılarak dPCR (QIAcuity, Qiagen) yöntemiyle belirlenmiştir. Nükleik asit ekstraksiyonu, ticari bir kit (Xi’an Tianlong Science&Technology Co, Çin) kullanılarak yapılmıştır. dPCR yönteminin infA, infB ve RSV için analitik duyarlılık (LoD) ve kantitasyon alt sınırı (LoQ), çalışma içi ve çalışmalar arası tekrarlanabilirliği ve doğrusallığı belirlenmiştir. dPCR ile çalışılan örnekler, kantitatif revers transkripsiyon gerçek zamanlı [quantitative reverse transcription realtime (qrRT)] PCR (qRT-PCR) ile de çalışılarak Ct değerleri belirlenmiştir. Ct değerleri ile dPCR-kantitasyon sonuçları arasındaki ilişki lineer regresyon ile değerlendirilmiştir. İstatistiksel analiz GraphPad Prism 10.4.0 (GraphPad, ABD) ve Excel Analysis ToolPak kullanılarak yapılmıştır. İnfA, infB ve RSV için dPCR yönteminin LoD değerleri sırasıyla 93.75, 15.59 ve 26.23 kopya/mL olarak belirlenmiştir. dPCR yönteminin çalışma içi tekrarlanabilirliği (varyasyon katsayısı, %CV), düşük viral yükü olan örneklerde daha yüksek olmak üzere 0.06-7.97 arası saptanmıştır. Çalışmalar arası tekrarlanabilirlik 0.73-5.41 olarak bulunmuştur. İnfA ve infB için 3-4 log10, RSV için 7 log10 aralığında dilüsyonlar ile yapılan doğrusallık analizinde her üç virüs için de r 2≥ 0.99 olarak bulunmuştur. dPCR ile ölçülen konsantrasyonların, qRT-PCR Ct sonuçları ile korele olduğu saptanmıştır. dPCR ile qRT-PCR testlerinin çalışma içi ve çalışmalar arası tekrarlanabilirlik sonuçları karşılaştırıldığında, dPCR’nin %CV değerinin anlamlı olarak daha düşük olduğu saptanmıştır (p= 0.0312). Çalışma sonuçları dPCR yönteminin, kantitatif nükleik asit standartları elde etmede tekrarlanabilirliği yüksek ve güvenilir bir yöntem olduğunu göstermiştir. Elde edilen kantitatif standartlar ile viral yük belirlemeye yönelik tanı yöntemleri geliştirmek ve/veya bu tür testlerin yöntem onayı analizlerini yapmak mümkündür. Sonuç olarak çalışmada, havuzlanmış hasta örnekleri kullanılarak dPCR yöntemiyle infA, infB ve RSV için güvenilir kantitatif nükleik asit standartlar elde edilmiş ve dPCR yönteminin performans analizleri gerçekleştirilmiştir. Bu çalışma, dPCR ile kantitatif viral nükleik asit standartlarının üretimine bir örnek olmuştur.