Development of G-quadruplex assisted hybridization chain reaction system

Abstract

Hibridizasyon zincir reaksiyonu (HCR) nükleik asitlerin teşhisi için kullanılan ve enzim gerektirmeyen bir tekniktir. Bu teknikte hedef molekül olan DNA veya RNA ile hibridizasyon kaskadı başlatılır ve ortamda bulunan hairpin sekansları arasında "toehold mediated strand displacement" aracılığı ile gerçekleştirilir. Sonuçta amaç sinyal amplifikasyonunu gerçekleştirmektir. HCR metodu PCR (polimerizasyon zincir reaksiyonu) metoduna alternatif olarak düşünülse de halen daha ölçüm hassasiyetinin düşük olması yeni tasarımlar yapılmasına yönlendirmiştir. Bu tezde de yeni bir HCR tasarımı ile ilgili çalışma gerçekleştirilmiştir. G-quadrupleks denilen alternatif DNA yapılarının yardımı ile floresan etiketleme tekniklerinin de kullanılması sonucunda yeni bir HCR mekanizması geliştirilmiştir. Bu tasarımda teşhis limitinin düşük olması ve ölçüm hassasiyetinin yüksek olması amaçlanmıştır. Bu tezde açıklanan HCR sistemi 20 pM kadar düşük konsantrasyon seviyesinde nükleik asit teşhisi için G-quadrupleks ve floresan etiketlemeyi birlikte kullanmıştır. Bu çalışmada kullanılan Amplex Red (™)'in floresan artışını sağladığı ve teşhis limitini 10 kat düşürdüğü sonucuna ulaşılmakta ve bu tezde açıklanmaktadır.

Hybridization chain reaction (HCR) is a technique used for the diagnosis of nucleic acids and does not require an enzyme. In this technique, the hybridization cascade is initiated with the target molecule DNA or RNA, and this is accomplished by means of toehold mediated strand displacement between hairpin sequences in the environment. Ultimately, the goal is to achieve signal amplification. Although the HCR method is considered as an alternative to the PCR (polymerization chain reaction) method, its still low measurement sensitivity has led to new designs. In this thesis, a study was carried out on a new HCR design. A new HCR mechanism has been developed as a result of the use of fluorescent labeling techniques with the help of alternative DNA structures called G-quadruplex. In this design, it is aimed that the detection limit is low and the measurement sensitivity is high. The HCR system described in this thesis used G-quadruplex and fluorescent labeling together for the diagnosis of nucleic acid at concentration levels as low as 20 pM. It is concluded that the Amplex Red (™) used in this study provides an increase in fluorescence and reduces the diagnostic limit by 10 times and is explained in this thesis.