Investigating the functional mechanisms of proteolysis via FTIR and CD spectroscopy

Abstract

Peptit bağlarının enzimatik parçalanması proteoliz olarak bilinir ve protein polipeptit zincirinin enzimlerle peptit bağlarını parçalayarak bozulmasına neden olan doğal bir süreçtir. Proteoliz mekanizması ilaç, gıda ve biyoteknoloji sektörlerinde önemli bir yere sahiptir. Bu çalışmada, hidroliz sırasında sıcaklıkla birlikte hem su-etanol karışımları hem de döteryum oksit tamponu varlığında ß-kazeinin zamana bağlı moleküler değişikliklerini incelerken aynı zamanda su-etanol karışımında sığır serum albümininin (BSA) moleküler değişimlerinin incelenmesi amaçlanmıştır. Bu çalışmada ß-kazeinin sekonder yapısındaki değişiklikler Fourier dönüşümlü kızılötesi (FTIR) spektroskopisi ile izlenirken, BSA'nın sekonder yapı değişiklikleri Dairesel Dikroizm (CD) spektroskopisi ile incelenmiştir. Her iki spektroskopik tekniğin uygulanabilirliği, farklı sıcaklıklarda ve farklı tampon koşullarında ß-kazein ve BSA'nın triptik hidrolizi sırasında spektral değişikliklerin izlenmesiyle gösterilmiştir. FTIR spektroskopisi sonuçlarına göre en önemli değişiklikler amid I ve amid II bölgelerinde (1700-1500 cm-1) meydana gelmektedir. Ayrıca serbest bırakılan ürünler olarak karboksil gruplarının (asimetrik gerilme titreşimleri: vas(COO-)) ve NH gruplarının (NH eğilme titreşimleri) IR sinyalleri 1585-1613 cm-1 aralığında yükseldiği gözlemlendi. ß-kazeinin konformasyonel değişikliklerinin izlenmesi için gelişmiş veri analizi uygulandı. Ayrıca, FTIR spektroskopisi sonuçlarına 'iki boyutlu korelasyon spektroskopisi (2DCOS) analizi' ve 'curve-fitting analizi' uygulanmıştır. CD spektroskopi sonuçlarından elde edilen verilerle, etanol varlığında BSA'nın yapısal bileşenlerinin hidroliz sırasında parçalandığı ve bozulduğu ortaya konulmuştur. Sonuç olarak, bu çalışmada biyoteknolojik teknikler ve proteomik çalışmalara fayda sağlayacak yeni metodolojik yaklaşımlar aydınlatılmıştır.

The enzymatic breakdown of peptide bonds is known as proteolysis and it is a natural process that causes protein polypeptide chain to degrade via cleaving peptide bonds with enzymes. The proteolysis mechanism has significant importance in the pharmaceutical, food and biotechnological sectors. This study aimed to explore the time-dependent molecular alterations of ß-casein in the presence of both water-ethanol mixtures and deuterium oxide buffer whereas the molecular alterations of bovine serum albumin (BSA) in water-ethanol mixtures together with the heat treatment throughout the hydrolysis. In this study, the alterations in the secondary structure of ß-casein were monitored with Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy while the secondary structure changes of BSA were monitored with Circular Dichroism (CD) spectroscopy. The applicability of both spectroscopic techniques was attempted to be demonstrated by monitoring spectral changes during tryptic hydrolysis of ß-casein and BSA at different temperatures and in different buffer conditions. According to the results of FTIR spectroscopy, the most significant alterations occur in the amide I and amide II regions (1700-1500 cm-1). Furthermore, as liberated products, the infrared signals of carboxylate groups (asym. stretch vibrations: vas (COO-)) and NH groups (NH bending vibrations) rise in the range of 1585-1613 cm-1. For monitoring the conformational changes of ß-casein, advanced data analysis was applied. Furthermore, 'two-dimensional correlation spectroscopy (2DCOS) analysis and curve-fitting analysis were applied to the FTIR spectroscopy results. CD spectroscopy results revealed that with the addition of ethanol, the structural components of BSA broken down and degraded upon hydrolysis. In conclusion, new methodological approaches were elucidated that will be beneficial to the biotechnological techniques and proteomics studies.