Structural and affinity analysis of selex-generated aptamers and optimization through in-silico mutagenesis

Abstract

Bu tezin amacı, SELEX metodu ile üretilen aptamerlerin kapsamlı bir yapısal analizini gerçekleştirmek ve bu analize dayanarak, afinitesini artırmak için modifiye edilmiş bir aptamer oluşturmak amacıyla bir iş akışı tasarlamaktır. İlk olarak, biyoiformatik yazılımları ile bir aptamer dizisinden 2D ve 3D yapılar elde edilerek, aptamerlerin fiziksel yapıları detaylıca incelenmiştir. Moleküler yerleştirme yöntemi ve moleküler dinamik (MD) simülasyonları kullanılarak, aptamerin hedef molekülle etkileşimi analiz edilmiştir. Devamında, in-silico mutajen yoluyla elde edilen aptamerle hedef molekülün afinitesinin iyileştirilip iyileştirilemeyeceği araştırılmıştır. Hedef hormonuna karşı, aptamerin performansının iyileştirilmesi için moleküler etkileşimler analiz edilmiş ve bağlanma afinitesini artırabilecek mutasyonlar önerilmiştir. Çalışmada, literatürdeki alsager22 aptamerinin 2D ve 3D yapıları ve hedef hormonu olan östradiol ile bağlama bölgesi elde edilmiştir. Afinite analizi sonucunda, aptamerin östradiolle en iyi afinite göstermesine rağmen, hedef dışı hormonlar olan progesteron, testosteron, androstenedionla beklenmedik etkileşimleri saptanmıştır. 63 potansiyel mutant aptamer arasından seçilen mutant alsager22 ile yapılan ileri analizler, mutasyonun aptamerin genel yapısını ve hormon bağlanma bölgesini değiştirdiğini göstermiştir. Bu doğrultuda, güvenilir ve tekrarlanabilir bir süreç olmadığı için mutasyon ile daha iyi afinite elde edileceği genel kanısına varılamamıştır. Yine de ΔG değerleri karşılaştırıldığında çalışma boyunca en yüksek afinite, seçilen mutant aptamer ve östradiol ile gerçekleştirilen MD simülasyonunda gözlemlenmiştir. Bu bulgular, mutasyonla daha iyi afinite elde etme olasılığının varlığını, ancak çok fazla mutasyon olasılığı olduğu için kapsamlı bir işlem gücü gerektiğini ortaya koymaktadır.

The aim of this thesis is to perform a comprehensive structural analysis of aptamers produced by the SELEX method and design a workflow to generate an aptamer modified to increase its affinity. Firstly, the physical structures of aptamers were analyzed in detail by obtaining 2D and 3D structures from an aptamer sequence with bioinformatics software. Using molecular docking and dynamics, the interaction of the aptamer with the target molecule was analyzed. Subsequently, it was investigated whether the affinity of the target molecule with the existing aptamer could be improved through in-silico mutagenesis. Molecular interactions were analyzed to improve the performance of the aptamer against the target hormones, and mutations that could increase the binding affinity were proposed. In the study, the 2D and 3D structures of the alsager22 aptamer in the literature and the binding site with estradiol were obtained. Affinity analysis revealed unexpected interactions with non-target hormones such as progesterone, testosterone, and androstenedione, although it showed the best affinity with estradiol. Further analysis with the selected mutant alsager22 showed that the mutation alters the overall structure of the aptamer and the hormone binding site. Accordingly, it cannot be generally concluded that better affinity would be achieved by mutation, as it is not a reliable and reproducible process. Nevertheless, the highest affinity was observed in the MD simulation with the selected mutant aptamer and estradiol. These findings suggest that the possibility of obtaining better affinity by mutation exists but requires extensive processing power as there are too many mutation possibilities.