Investigation the Functions of Novel G-Quadruplex Structures in E. Coli Genome

Abstract

G-dörtlüleri nükleik asit moleküllerinin özel üçüncül yapılardan biri olup kanonik olmayan topolojilerdir. Yıllar boyunca birçok organizmadaki G-dörtlülerinin biyolojik rolleri incelenmiş ve ortaya çıkarılmıştır. Özellikle insan genomunun düzenleyici bölgelerinde bulunması G-dörtlülerinin düzenleyici rollerini ve hücre metabolizmasındaki önemini göstermektedir. Escherichia coli (E. coli) proteomik ve genomik yapılarının detaylıca ortaya çıkarılması ile laboratuvar uygulamalarında model organizma haline gelerek günümüzde en popüler bakteriyel organizmalardan birisidir. Bu zamana kadar E. coli genomunda çeşitli genlerin yakınında bulunan 52 G-dörtlüsü oluşturan sekans hesaplama araçları ile analiz edilmiştir. Ancak biyolojik fonksiyonları henüz keşfedilmemiştir. Bu bağlamda bu çalışmada G-dörtlülerinin biyolojik rolleri G-dörtlüsüne bağlanan proteinlerin MALDI-TOF-TOF tekniği ve CRISPR/Cas9 tekniğiyle G-dörtlüsü nakavtının civarındaki genlerin ekspresyon seviyesine olan etkisinin araştırılmasıyla incelenmiştir. MALDI-TOF-TOF sonuçları uyumlu moleküler ağırlıkları ve eşleşme skorları göz önünde bulundurularak asetaldehit alkol dehidrogenaz (adh) ve DNA bağımlı RNA polimeraz beta altbirimi olarak iki farklı proteinin G-dörtlüsüne bağlanan protein olmak üzere yüksek olasılığa sahip olduğunu göstermiştir. Bu doğrultuda G-dörtlülerinin alkol fermentasyonu işleminde ve yakın genlerin transkripsiyonunda rol oynadığı tahmin edilmektedir. Ancak maalesef ki bu çalışma doğrultusunda geliştirilen ve G-dörtlülerinin yüksek stabilite sahip olmasından dolayı G-dörtlülerini düzenleyemeyen CRISPR/Cas9 yaklaşımının iyileştirilmesi gerekmektedir. G-dörtlülerinin biyolojik fonksiyonlarının ortaya çıkarılması bakteri metabolizmasındaki önemine ışık tutacak ve gelecek çalışmalar için bir mihenk taşı olacaktır.

G-quadruplexes are noncanonical topologies with special tertiary structures of nucleic acid molecules. During many years biological roles of G-quadruplexes have been investigated and revealed in various organisms. In particular, the regulatory functions of G-quadruplexes by foundation on regulatory regions of human genome demonstrates their significance on cellular metabolism. Escherichia coli (E. coli) is one of the most popular bacterial organisms by being model organisms in laboratory studies since its genomic and proteomic structures have been revealed with details. So far 52 G-quadruplex forming sequences closer to various genes on E. coli genome had been analyzed with computational tools. However, their biological functions have not been discovered yet. As such, functions of those G-quadruplex structures were investigated in this study by characterizing G-quadruplex binding protein with MALDI-TOF-TOF technique and looking for effect of G-quadruplex knock-outs on expression levels of adjacent genes with CRISPR/Cas9 technique. MALDI-TOF-TOF results have demonstrated that two distinct proteins which are acetaldehyde alcohol dehydrogenase and DNA dependent RNA polymerase beta subunit have great possibility to being G-quadruplex binding protein considering the appropriate molecular weights and matching scores. In this scope, it's predicted that the G-quadruplexes could act a role on alcohol fermentation process and transcription of adjacent genes. However, unluckily CRISPR/Cas9 approach which is developed in this study have to be improved since that G-quadruplexes have not been edited due to their higher stability. The revealing of biological functions of G-quadruplexes will keep light to their significance on bacterial metabolisms and will be a milestone for further studies.