Computational Design of Nanobodies Targeting the Neoantigens of Oncogenic Kras G12 Mutations

Abstract

Pankreatik duktal adenokarsinom (PDAC), kötü prognozu ve sınırlı tedavi seçenekleri ile en ölümcül kanserlerden biri olmaya devam etmektedir. KRAS mutasyonları, özellikle G12 sıcak nokta kalıntısındaki mutasyonlar, PDAC'deki en yaygın ve en erken gerçekleşen olaylar arasında yer almaktadır. Bu nedenle, KRAS tarafından oluşturulan neoantijenler, antikorlar kullanılarak tanı ve tedavi için potansiyel hedefler olarak önerilmiştir. Ancak, antikorlar büyük makromoleküllerdir ve PDAC'nın yoğun ve nabız atan mikroçevresinin oluşturduğu zorluklarla karşı karşıya kalmaktadırlar. Bu çalışma, antikorların çok daha küçük karşılıkları olan nanobody'lerin hesaplamalı tasarımını amaçlamaktadır. Bu makromoleküller, KRAS G12 neoantijenlerini hedefleme ve daha önce belirtilen zorlukların üstesinden gelme potansiyeline sahip olabilirler. Nanobody'lerin tasarımı için, KRAS neoantijenlerine bağlandığı bilinen T-Hücre Reseptörleri ve antikorlardan alınan tamamlayıcı-belirleyici bölgeler, stabil bir nanobody iskeletine yerleştirildikten sonra, bu belirleyici bölgelerin eklenmesiyle oluşturulan nanobody'lerin 3 boyutlu yapıları oluşturulmuş ve KRAS G12 peptit-HLA (İnsan lökosit antijeni) komplekslerine karşı bağlanma ilişkileri, moleküler docking ve moleküler dinamik simülasyonları kullanılarak değerlendirilmiştir. Peptit-nanokor etkileşim enerjileri, Moleküler Mekanik Poisson-Boltzmann Yüzey Alanı (MM-PBSA) analizleri ile hesaplanmış ve daha ayrıntılı olarak 'decomposition' analizleri ile incelenmiştir. In silico sonuçlarımız, nanobody-9'un KRAS G12D neoantijenine spesifik bağlanma ilişkisi gösterdiğini ve aynı zamanda wildtype KRAS'tan ortaya çıkabilecek olası peptitler için düşük bağlanma ilişkisini koruduğunu ortaya koymuştur. Burada sunulan bulgular, daha ileri in vitro ve in vivo doğrulama deneylerini gerektirmektedir. Gelecekteki araştırmalar, nanobody-9'un tanısal ve terapötik potansiyelini keşfederek, nihai hedef olarak klinik uygulamalara yönelik ilerlemeyi sağlayabilir.

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) remains as one of the deadliest cancers, with poor prognosis and limited treatment options. KRAS mutations, particularly on the hotspot residue G12, are among the most prevalent and earliest driver events in PDAC. Hence, neoantigens formed by KRAS have been proposed as potential targets for diagnosis and therapy by utilizing antibodies. However, antibodies are large macromolecules, and they face challenges posed by the dense and pulsating PDAC microenvironment. This study aims to computationally design much smaller counterparts of antibodies, which are known as nanobodies. These macromolecules could target KRAS G12 neoantigens and are potentially capable of overcoming the challenges mentioned earlier. To design the nanobodies, complementarity-determining regions (CDRs) from T-Cell-Receptors (TCRs) and antibodies, which are already known to bind KRAS neoantigens, were grafted onto a stable nanobody scaffold. The 3D structures of grafted nanobodies were then generated and evaluated for their binding affinities towards KRAS G12 peptide-HLA (Human leukocyte antigen) complexes by employing molecular docking and molecular dynamics simulations. Peptide-nanobody interaction energies were calculated using Molecular Mechanics Poisson-Boltzmann Surface Area (MM-PBSA) analyses and further examined through decomposition calculations. Our in silico results demonstrated specific binding affinity of nanobody-9 towards the KRAS G12D neoantigen whilst also maintaining low binding affinity for possible peptides likely to be arisen from wildtype KRAS. The findings presented here warrant further in vitro and in vivo validation experiments. Future research could explore nanobody-9's diagnostic and therapeutic potential, with the ultimate goal of advancing toward a clinical application.