Yabani Kemiricilerde Eski Dünya Hantavirus IgG Antikorlarının Saptanması için ELISA ve İmmünoblot Yöntemlerinin Optimizasyonu

Abstract

Hantaviruslar, enfekte kemiricilerin salya, dışkı ve idrar gibi salgılarında bulunan virus partiküllerinin solunması ya da enfekte kemiricilerle direkt temas sonucu insanlara bulaşmaktadır. Ülkemizde, hantavirus tiplerinden Dobrava (DOBV), Puumala (PUUV), Saaremaa (SAAV), Tula (TULV) ve Seoul (SEOV) viruslarının taşıyıcısı olan kemirici türleri bulunmaktadır. Türkiye'deki kemiricilerde hantaviruslara özgül antikor varlığı, ilk kez 2004 yılında Karadeniz ve Ege bölgelerinden toplanan kemiricilerde gösterilmiştir. İlk renal sendromlu kanamalı ateş (RSKA) olguları ise 2009 yılında yine Karadeniz bölgesinden bildirilmiştir. Yaban hayatı ve sahadaki kemirici popülasyonlarında hantavirus prevalansının önceden belirlenmesi, hantaviruslara bağlı olguların durumu hakkında bilgi edinilmesi ve sahadaki risk durumunun ortaya konması açısından önem taşımaktadır. Kemiricilere ait örneklerin, DOBV ve PUUV gibi Avrasya'da sık görülen ve ülkemizde de görüldüğü bilinen bazı RSKA etkenleri açısından taranmasında kullanılabilecek şekilde optimize edilmiş bir ticari ürün bulunmamaktadır. Bu çalışmada, insan serumlarının taranması için üretilmiş, ticari enzim temelli immünolojik yöntem (ELISA) ve immünoblot testlerine ait antijenler kullanılarak, kemirici örneklerinde hantavirusa özgül antikorların taranmasına uygun testlerin optimizasyonu sağlanmıştır. ELISA (Anti-Hantavirus Pool ELISA; Euroimmun, Almanya) ve immünoblot (Euroline Anti-Hanta Profi le 1 strips; Euroimmun, Almanya) yöntemlerinin optimizasyonu için, en uygun serum ve konjugat dilüsyonları denenmiş ve ELISA yöntemi tarama, immünoblot yöntemi ise doğrulama amacıyla kullanılmıştır. Belirlenen bu prosedür ile, Apodemus ve Microtus türlerinden 84 kemiriciye ait serum örnekleri değerlendirilmiş ve elde edilen sonuçlar ile optimize edilen ELISA yönteminin eşik değeri, duyarlılık ve özgüllüğü saptanmıştır. ELISA yönteminin optimizasyonu için 1/50, 1/100 ve 1/200 serum dilüsyonları ile 1/10.000, 1/20.000 ve 1/40.000 konjugat dilüsyonları; immünoblot yönteminin optimizasyonu için ise 1/50 ve 1/100 serum dilüsyonları ile 1/5.000 ve 1/10.000 konjugat dilüsyonları değerlendirilmiştir. ELISA için "horseradish" peroksidaz enzimi ile işaretli keçi anti-fare IgG konjugatı, immünoblot için ise alkalen fosfataz ile işaretli keçi anti-fare IgG konjugatı kullanılmıştır. İnkübasyon süresi, yıkama sayısı ve substrat seçimi için üretici fi rmanın protokolü uygulanmıştır. ELISA yöntemi için 1/50 serum dilüsyonu ve 1/10.000 konjugat dilüsyonu, immünoblot için ise 1/100 serum dilüsyonu ve 1/5.000 konjugat dilüsyonu optimal değerler olarak belirlenmiştir. Optimize edilen ELISA yöntemiyle, belirlenen eşik değerine (ODantikor varlığı saptanmıştır. Doğrulama amacıyla kullanılan optimize immünoblot yöntemiyle ise, ELISA ile pozitif bulunan 22 örneğin -serum yetersizliği nedeniyle- 20'si çalışılmış ve 17'sinde DOBV antikor pozitifl iği saptanmıştır. Bu kemiricilerden 11'i Apodemus fl avicollis, üçü Apodemus agrarius, ikisi Microtus guentheri ve biri de Apodemus sylvaticus türlerine aittir. Her iki yöntem ile elde edilen sonuçlar karşılaştırıldığında, optimize ELISA yönteminin %100 duyarlılık ve %95 özgüllükte olduğu belirlenmiştir. Bu çalışma ile kemirici serumlarının taranmasında kullanılabilecek, kolaylıkla ulaşılabilen ticari ürünlerden elde edilen antijenlerin kullanıldığı, hızlı ve güvenilir sonuç veren bir yöntem oluşturulmuştur. Benzer çalışmalar ile farklı türden kemiricilere yönelik olarak optimize edilecek serolojik yöntemler, alanda aktif izlem ve denetleme çalışmalarının gerçekleştirilmesi açısından büyük önem taşımaktadır.