PubMed İndeksli Yayınlar Koleksiyonu / PubMed Indexed Publications Collection
Permanent URI for this collectionhttps://hdl.handle.net/20.500.14365/2
Browse
Browsing PubMed İndeksli Yayınlar Koleksiyonu / PubMed Indexed Publications Collection by Publisher "Ankara Microbiology Soc"
Now showing 1 - 3 of 3
- Results Per Page
- Sort Options
Article Citation - WoS: 2Citation - Scopus: 2Analysis of Nucleotide Changes in Rt-Pcr Primer/Probe Binding Regions in Sars-Cov Isolates Reported From Turkey(Ankara Microbiology Soc, 2021) Demir, Ayse Banu; Bulgurcu, Alihan; Appak, Ozgur; Sayiner, Ayca ArzuThe SARS-CoV-2 virus, which caused the COVID-19 epidemic, caused more than 55 million cases and nearly 1.5 million deaths worldwide. For the microbiological diagnosis of the disease, the most valid method is detecting the presence of the viral genome by real-time reverse transcription polymerase chain reaction (rRT-PCR). However, due to the nature of the RNA viruses, frequent mutations may affect the sensitivity of the analyses made on the genetic material of the virus, such as PCR. In this study, we aimed to investigate the mutations in the primer-probe binding regions of the rRT-PCR panels used in COVID-19 diagnosis. SARS-CoV-2 whole genome sequence data (n= 194) isolated from COVID-19 cases in Turkey and uploaded on GISAID database from the centers in Istanbul (n= 78), Ankara (n= 58), Kars (n= 47), Bursa (n= 2), Adiyaman (n= 2), Erciyes (n= 1) and Kocaeli (n= 1) between March 17-September 14, 2020 were analyzed. In order to determine the nucleotide changes, SARS-CoV-2 sequences from Turkey were compared to the reference genome sequence (NC_045512.1) present in GenBank website. The constructed data set was aligned using the MAFFT program and was checked manually if the sequences were in the same frame by using the AliView program. Primer-probe binding sites of the thirteen SARS-CoV-2 rRT-PCR panels from seven different institutes (US CDC, China CDC, Charite CDC, Pasteur, HKU, Thailand, NIID) that are being used in COVID-19 diagnosis were evaluated in terms of nucleotide changes within the corresponding regions compared to the reference genome. Sequence diversities in the viral genomes were determined via positional nucleotide numerical calculator and entropy calculator modules and nucleotide and entropy changes in primer-probe binding regions for each rRT-PCR panel were examined. Among thirteen different primer-probe panels, nucleotide changes in the target regions of the seven primer-probe panels were determined. When viral sequences with nucleotide changes in the primer-probe binding regions were examined, the most common changes were observed in the China CDC N-forward primer and US CDC N3-forward primer binding regions. It is important that the kits to be used as diagnostic tests are designed specific to the regions with less nucleotide changes. Nucleotide changes may not be critical for DNA amplification for most PCR panels, but should be carefully monitored as they may affect the sensitivity of the assay. If the risk of alteration of the designed region is high, the primer - probe binding sites should be checked frequently and updated when necessary.Article İnfluenza A/B Virüs ve RSV Validasyon Standartlarının Dijital PCR ile Kantitasyonu(Ankara Microbiology Soc, 2025) Sayıner, Ayca Arzu; Bulgurcu, AlıhanMikrobiyolojik tanı laboratuvarlarında kullanılacak tanı testleri için kantitatif standartların kullanıldığı yöntem doğrulama (verification) veya geçerli kılma (validation) çalışmaları gereklidir. Nükleik asit testlerinde sentetik nükleik asit veya plazmit yerine tam virüs içeren standartların kullanılması; ekstraksiyon, revers transkripsiyon ve amplifikasyonu içerecek şekilde tanı testinin tüm basamaklarının gerçek yaşam koşullarında değerlendirilmesini sağlar. Solunum yolu virüsleri için nükleik asit testlerine yönelik ticari kantitatif standart materyaller sınırlıdır. Bu çalışmada; influenza A virüs (infA), influenza B virüs (infB) ve respiratuvar sinsityal virüs (RSV) için dijital polimeraz zincir reaksiyonu [digital polymerase chain reaction (dPCR)] kullanılarak, kantitatif nükleik asit standartları geliştirilmesi amaçlanmıştır. Çalışmada; RSV, infA, infB RNA pozitif olduğu bilinen nazofarengeal sürüntü örneklerinin havuzlanmasıyla hazırlanan örneklerdeki viral nükleik asit miktarı, ticari primer/prob setleri (Qiagen, Almanya) kullanılarak dPCR (QIAcuity, Qiagen) yöntemiyle belirlenmiştir. Nükleik asit ekstraksiyonu, ticari bir kit (Xi’an Tianlong Science&Technology Co, Çin) kullanılarak yapılmıştır. dPCR yönteminin infA, infB ve RSV için analitik duyarlılık (LoD) ve kantitasyon alt sınırı (LoQ), çalışma içi ve çalışmalar arası tekrarlanabilirliği ve doğrusallığı belirlenmiştir. dPCR ile çalışılan örnekler, kantitatif revers transkripsiyon gerçek zamanlı [quantitative reverse transcription realtime (qrRT)] PCR (qRT-PCR) ile de çalışılarak Ct değerleri belirlenmiştir. Ct değerleri ile dPCR-kantitasyon sonuçları arasındaki ilişki lineer regresyon ile değerlendirilmiştir. İstatistiksel analiz GraphPad Prism 10.4.0 (GraphPad, ABD) ve Excel Analysis ToolPak kullanılarak yapılmıştır. İnfA, infB ve RSV için dPCR yönteminin LoD değerleri sırasıyla 93.75, 15.59 ve 26.23 kopya/mL olarak belirlenmiştir. dPCR yönteminin çalışma içi tekrarlanabilirliği (varyasyon katsayısı, %CV), düşük viral yükü olan örneklerde daha yüksek olmak üzere 0.06-7.97 arası saptanmıştır. Çalışmalar arası tekrarlanabilirlik 0.73-5.41 olarak bulunmuştur. İnfA ve infB için 3-4 log10, RSV için 7 log10 aralığında dilüsyonlar ile yapılan doğrusallık analizinde her üç virüs için de r 2≥ 0.99 olarak bulunmuştur. dPCR ile ölçülen konsantrasyonların, qRT-PCR Ct sonuçları ile korele olduğu saptanmıştır. dPCR ile qRT-PCR testlerinin çalışma içi ve çalışmalar arası tekrarlanabilirlik sonuçları karşılaştırıldığında, dPCR’nin %CV değerinin anlamlı olarak daha düşük olduğu saptanmıştır (p= 0.0312). Çalışma sonuçları dPCR yönteminin, kantitatif nükleik asit standartları elde etmede tekrarlanabilirliği yüksek ve güvenilir bir yöntem olduğunu göstermiştir. Elde edilen kantitatif standartlar ile viral yük belirlemeye yönelik tanı yöntemleri geliştirmek ve/veya bu tür testlerin yöntem onayı analizlerini yapmak mümkündür. Sonuç olarak çalışmada, havuzlanmış hasta örnekleri kullanılarak dPCR yöntemiyle infA, infB ve RSV için güvenilir kantitatif nükleik asit standartlar elde edilmiş ve dPCR yönteminin performans analizleri gerçekleştirilmiştir. Bu çalışma, dPCR ile kantitatif viral nükleik asit standartlarının üretimine bir örnek olmuştur.Article Citation - WoS: 2Citation - Scopus: 2Optimization of Elisa and Immunoblot Methods for the Detection of Igg Antibodies Against Old World Hantaviruses in Wild Rodents(Ankara Microbiology Soc, 2016) Polat, Ceylan; Karatas, Ahmet; Sozen, Mustafa; Matur, Ferhat; Abacioglu, Hakan; Oktem, Mehmet AliHantaviruses infect humans via inhalation of viral particles in infected rodents' secretions such as saliva, urine and faeces or via direct contact with infected rodents. The rodent species that are known as the carriers of Dobrava (DOBV), Puumala (PUUV), Saaremaa (SAAV), Tula (TULV) and Seoul (SEOV) viruses are found in our country. The presence of specific antibodies against hantaviruses have been demonstrated in rodents collected from Black Sea and Aegean Regions of Turkey in 2004 for the first time. The first hantavirus-related hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS) cases were reported in Black Sea region in 2009. The determination of the hantavirus prevalence in wild life and rodent populations in the field is crucial for the information about hantavirus-related cases and to clarify the state of risk. There is no commercial product optimized for the screening of rodent serum samples in terms of HFRS agents like DOBV and PUUV that are widely seen in Eurasia as well as Turkey. In this study, the antigens belonging to the commercial enzyme-linked immunoassay (ELISA) and immunoblot tests that are produced for the screening of human sera were used for the development of antibody screening tests against hantavirus in rodent sera and were optimized. The most appropriate serum and conjugate dilutions were determined for the optimization of ELISA (Anti-Hantavirus Pool ELISA; Euroimmun, Germany) and immunoblot (Euroline Anti-Hanta Profile 1 strips; Euroimmun, Germany) methods. Optimized ELISA method was used for the screening and optimized immunoblot method was used for the confirmation. A total of 84 wild rodent sera that belonged to Apodemus and Microtus species were evaluated with this procedure and the cut-off value, sensitivity and specificity of optimized ELISA method were determined. For the optimization of ELISA 1/50, 1/100 and 1/200 serum dilutions and 1/10.000, 1/20.000 and 1/40.000 conjugate dilutions were tested. For the optimization of immunoblot, 1/50 and 1/100 serum dilutions and 1/5.000 and 1/10.000 conjugate dilutions were tested. The horseradish peroxidase conjugated goat anti-mouse IgG for ELISA and the alkaline phosphatase conjugated goat anti-mouse IgG for immunoblot were used. We followed the manufacturer's recommendations for the incubation parameters, substrate and the number of washes. 1/50 serum dilution and 1/10.000 conjugate dilution for ELISA and 1/100 serum dilution and 1/5.000 conjugate dilution for immunoblot were determined as optimal concentrations. By using the optimized ELISA, 26.2% (22/84) of rodents were found positive for hantavirus antibodies according the determined cut-off value (OD450/620: 0.325). By using immunoblot as a confirmatory test, 20 out of 22 ELISA positive samples could be studied because of the insufficient amount of sera and 17 of them was found positive in terms of DOBV antibodies. Of these rodents 11 were Apodemus flavicollis, three were Apodemus agrarius, two were Microtus guentheri and one was Apodemus sylvaticus. When the results of ELISA were compared to immunoblot results, the optimized ELISA's sensitivity and specificity were found as 100% and 95%, respectively. In this study, a method that can be used in the screening of rodent sera was constituted which uses commercial antigens that can be provided easily, gives fast and reliable results. Similar serological methods optimized for different types of rodents are of great importance for the realization of active follow-up and monitoring of the studies in the field.